Projekt odprtih protiteles je globalno raziskovalno sodelovanje, ki ga skupaj spodbujajo UC Davis, NIH NeuroMab Facility, DSHB in Addgene. Njegov cilj je obravnavati krizo ponovljivosti protiteles s standardizacijo, preglednostjo in odprto izmenjavo. Njegovo izvajanje ni ohlapna pobuda, ampak šest-stopenjski inženirski proces, ki je izvedljiv, revizijski in ponovljiv.
1. Standardizirano pridobivanje in predložitev genskih zaporedij protiteles
Vir: Antigen{0}}specifične celice B so izolirane iz imuniziranih živali ali ozdravljenih bolnikov s tehnologijo razvrščanja posameznih celic B (kot je FACS). BCR mRNA se ekstrahira in pomnoži z RT-PCR, da se pridobijo popolna zaporedja V(D)J težke in lahke verige.
Zahteve glede formata: Zaporedje mora biti v formatu FASTA in vključevati opombe za genske fragmente V, D in J.
Vključeni morajo biti podatki o imunogenih (ime antigena, vrsta, postopek imunizacije).
Izvor kloniranja mora biti naveden (npr. "človeški darovalec št. 27, po-SARS-okužbi s CoV-2").
Platforma za oddajo: Predložite neobdelane podatke o zaporedju prek obrazca »Predlagajte plazmid« družbe Addgene.
Ključne točke: Zaporedje mora biti gen rekombinantnega protitelesa; predložitev protiteles za razsekvenciranje, pridobljenih iz hibridomov, je prepovedana.
2. Konstrukcija plazmida in zgrajena sestava ekspresijskega vektorja
Izbira vektorja: Uporabite standardne ekspresijske vektorje sesalcev (npr. pCMV ali pEF1), pri čemer zagotovite vključitev konstantne regije IgG1 Fc in Kozakovega zaporedja.
Metoda kloniranja: Uporabite sklop Gibson ali kloniranje Golden Gate, da dosežete naravno združevanje težkih in lahkih verig, pri čemer se izogibajte naključnim kombinacijam.
Dogovori o poimenovanju plazmidov:
OpenAb_[Antigen]_[Vrsta]_[ID klona]_v1
Primer: OpenAb_SARS2_Spike_hu_047_v1
3. Oddaja in pregled prek platforme Addgene
Vnos oddaje: Dostop do obrazca Addgene Suggest a Plasmid
Kriteriji pregleda: zaporedje brez kontaminacije in mutacij s premikanjem okvirja; Plazmid vsebuje popoln promotor in terminator; Navedite zemljevid plazmida (datoteka .gb)
Čas pregleda: običajno 7–14 delovnih dni. Po odobritvi se dodeli ID Addgene (npr. #123456) in plazmid se javno doda v bazo podatkov.
Rezultat: Plazmid postane globalno iskalni vir, ki je brezplačno na voljo vsem raziskovalcem.
4. Standardizirano ustvarjanje in nalaganje validacijskih podatkov
Metode validacije: morajo biti v skladu s petimi stebri IWGAV (Mednarodna delovna skupina za validacijo protiteles):
|
Vrsta preverjanja |
Metoda |
Zahteve |
|
Genetska validacija |
CRISPR knockout/knockdown ciljnega proteina |
Izginotje ali znatno zmanjšanje pasov WB |
|
Ortogonalna validacija |
Primerjava z rezultati masne spektrometrije ali RNA-seq |
Dosleden vzorec izražanja |
|
Neodvisna validacija protiteles |
Navzkrižna-validacija z uporabo protiteles z različnimi epitopi |
Dosledni rezultati |
|
Funkcionalna validacija |
Nevtralizacijski test, pretočna citometrija |
Dokazuje pričakovano biološko funkcijo |
|
Validacija aplikacije |
IHC, IF, WB, FC |
Specifično barvanje za ciljno aplikacijo |
Format podatkov:
Slike IHC/IF: Vključevati morajo negativno kontrolo (izločeno tkivo) in pozitivno kontrolo.
WB slike: Vključevati morajo oznake molekulske mase in notranje kontrole (npr. -aktin).
Vse slike je treba naložiti v formatu TIFF brez izgub, skupaj z eksperimentalnimi parametri (razmerje razredčitve protiteles, čas izpostavljenosti).
Obvezna zahteva: Vsi validacijski podatki morajo biti objavljeni v povezavi s plazmidi; nobeno ni pogrešljivo.
5. Globalna brezplačna distribucija in uporaba
Način dostopa:
Obiščite Addgene Antibody Plasmid Collection
Poiščite ciljno protitelo (npr. "OpenAb_SARS2_Spike")
Predložite pogodbo o-nekomercialni uporabi (plačilo ni potrebno)
Prejmite plazmid (običajno 5–10 delovnih dni)
Navodila za uporabo:
V prispevku je treba navesti ID Addgene in izvirni vir zaporedja.
Spodbujajte predložitev novih validacijskih podatkov nazaj v Addgene, da oblikujete ekosistem zaprte-zanke.
6. Nenehne povratne informacije in ponavljanje ekosistema
Mehanizem povratnih informacij o podatkih: uporabniki naložijo nove eksperimentalne rezultate (npr. nove aplikacije, nova reaktivnost vrst) na platformo Addgene in tvorijo dinamično validacijsko zbirko podatkov.
Upravljanje skupnosti: DSHB in NIH redno objavljata poročila o kakovosti protiteles, ki izločajo neučinkovita ali navzkrižno{0}}reaktivna protitelesa.
Rezultati: Od leta 2025 je 89 % raziskav, ki uporabljajo odprtokodna protitelesa, mogoče neodvisno reproducirati, kar daleč presega 45 % za komercialna protitelesa.
